本发明大体上涉及通过短暂降低循环中的系统性免疫抑制水平来治疗中枢神经系统(cns)的疾病、病症、病况或损伤的方法和组合物。
背景技术：
大多数中枢神经系统(cns)病理共有共同的神经炎性组分，它是疾病进展的一部分，并且有助于疾病的扩大。在这些病理中，阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease)(ad)是一种年龄相关的神经变性疾病，其特征在于记忆和认知功能的进行性丧失，其中淀粉样蛋白β(aβ)肽聚集物的累积被认为在cns内的炎性级联中起关键作用，最终导致神经元损害和组织破坏(akiyama等，2000；hardy和selkoe，2002；vomberg等，2012)。尽管在神经变性疾病中有慢性神经炎性应答，但过去十年研究神经变性疾病中基于免疫抑制的疗法的临床和临床前研究已提出关于抗炎药物为何没有达到目标的问题(breitner等，2009；group等，2007；wyss-coray和rogers，2012)。我们提供了克服ad以及中枢神经系统的类似疾病和损伤的现有疗法的缺点的新颖的答案；该方法是基于我们对系统性免疫系统和中枢免疫系统的不同组分在中枢神经系统维护和修复中的作用的独特理解。
技术实现要素：
在一个方面，本发明提供了包含活性剂的药物组合物，所述活性剂通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起个体中系统性免疫抑制水平的降低，所述药物组合物用于治疗cns的疾病、病症、病况或损伤，不包括自身免疫性神经炎性疾病复发缓解型多发性硬化(rrms)在内，其中所述药物组合物用于通过包括至少两个疗程的给药方案进行施用，每个疗程依次包括治疗期，之后是非治疗的间隔期；并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：icos-b7rp1、t细胞激活的v结构域ig抑制剂(vista)、b7-cd28样分子、cd40l-cd40、cd28-cd80、cd28-cd86、b7h3、b7h4、b7h7、btla-hvem、cd137-cd137l、ox40l、cd27-cd70、干扰素基因刺激蛋白(sting)、t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(tigit)以及a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸。
在另一方面，本发明提供用于治疗不包括自身免疫性神经炎性疾病复发缓解型多发性硬化(rrms)在内的中枢神经系统(cns)的疾病、病症、病况或损伤的方法，所述方法包括向有需要的个体施用根据本发明的包含活性剂的药物组合物，所述活性剂通过释放由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起全身性免疫抑制水平的降低，其中所述药物组合物是通过包括至少两个疗程的给药方案施用的，每个疗程依次包括治疗期，之后是非治疗时期的间隔期，并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：icos-b7rp1、t细胞激活的v结构域ig抑制剂(vista)、b7-cd28样分子、cd40l-cd40、cd28-cd80、cd28-cd86、b7h3、b7h4、b7h7、btla-hvem、cd137-cd137l、ox40l、cd27-cd70、干扰素基因刺激蛋白(sting)、t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(tigit)以及a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸。
附图说明
图1a-b描绘了在5xfadad转基因(ad-tg)小鼠模型中沿疾病进展的脉络丛(cp)活性。(a)在从1月龄、2月龄、4月龄和8月龄的ad-tg小鼠分离的cp中，通过rt-qpcr测量的基因icam1、vcam1、cxcl10和ccl2的mrna表达水平，其显示为与年龄匹配的wt对照相比的倍数变化(n＝6-8只/组；每个时间点的学生t检验(student'sttest))。(b)针对上皮紧密连接分子密封蛋白(claudin)-1、hoechst核染色和整合素配体icam-1免疫染色的8月龄ad-tg小鼠和年龄匹配的wt对照的cp的代表性显微图像(比例尺，50μm)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图2a-c显示了(a)年幼和年老的非患cns的ad患者的人死后cp中icam-1免疫反应性的定量(n＝5名/组；单因素方差分析(one-wayanova)，之后是纽曼-科伊尔斯(newman-keuls)事后分析)；(b)在8月龄ad-tg小鼠和年龄匹配的wt对照的cp中表达ifn-γ的免疫细胞(经细胞内染色，并在cd45上进行预先门控)的流式细胞术分析。阴影直方图表示同种型对照(n＝4-6只/组；学生t检验)；和(c)与年龄匹配的wt对照相比，在从4月龄和8月龄ad-tg小鼠分离的cp组织中，通过rt-qpcr测量的ifn-γ的mrna表达水平(n＝5-8只/组；每个时间点的学生t检验)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图3a-b描绘了(a)在8月龄ad-tg小鼠和wt对照小鼠中的cd4+foxp3+脾细胞频率(在tcrβ上进行预先门控)的代表性流式细胞术图；和(b)来自1个月、2个月、4个月和8个月的ad-tg小鼠和wt对照小鼠的脾细胞的定量分析(n＝6-8只/组；每个时间点的学生t检验)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图4显示在最后一次注射dtx后1天后，来自ad-tg/foxp3-dtr+/-小鼠的脾细胞的门控策略和代表性流式细胞术图。将dtx经腹膜内连续注射4天，实现foxp3+细胞的约99％消耗。
图5a-g显示了ad-tg小鼠中treg的短暂消耗的作用。(a)用dtx将ad-tg/foxp3-dtr+(其表达dtr转基因)和非表达dtr的ad-tg同窝对照组(ad-tg/foxp3-dtr-)治疗连续4天。在最后一次dtx注射后1天后，在6月龄的经dtx治疗的ad-tg小鼠中，通过rt-qpcr测量的基因icam1、cxcl10和ccl2的cpmrna表达水平(n＝6-8只/组；学生t测试)。(b-d)在最后一次dtx注射后3周，6月龄的经dtx治疗的ad-tg小鼠和对照的脑实质(不包括脉络丛，其被分开切除)的流式细胞术分析。在用dtx治疗的ad-tg/foxp3-dtr+小鼠和ad-tg/foxp3-dtr-对照的脑实质中，显示cd11b高/cd45高mo-mφ和cd4+t细胞的增加的数量的定量流式细胞术分析(b)，以及cd4+foxp3+treg频率的代表性流式细胞术图(c)和定量分析(d)(n＝3-7只/组；学生t检验)。(e)在最后一次dtx注射后3周，在6月龄的经dtx治疗的ad-tgad-tg/foxp3-dtr+和ad-tg/foxp3-dtr-对照的脑实质中foxp3和il10的mrna表达水平(n＝6-8只/组；学生t检验)。(f)gfap免疫染色的定量分析，显示在最后一次dtx注射后3周，来自6月龄的经dtx治疗的ad-tg/foxp3-dtr+和ad-tg/foxp3-dtr-对照小鼠的海马切片的星形胶质细胞增生的减少(比例尺50μm；3-5只/组；学生t检验)。(g)在最后一次dtx注射后3周，脑实质中il-12p40和tnf-a的mrna表达水平(n＝6-8只/组；学生t检验)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图6a-e显示了treg短暂消耗对aβ斑块学习/记忆表现的作用。在最后一次dtx注射后3周，5月龄的经dtx治疗的ad-tg/foxp3-dtr+和ad-tg/foxp3-dtr-对照小鼠的针对aβ斑块免疫染色和hoechst核染色的脑的(a)代表性显微图像和(b)定量分析(比例尺，250μm)。对海马齿状回(dg)和大脑皮质第5层中的平均aβ斑块面积和数量进行定量(在6μm脑切片中；n＝5-6只/组；学生t检验)。图6c-e)显示最后一次dtx注射后3周，6月龄的经dtx治疗的ad-tg/foxp3-dtr+小鼠和对照小鼠的莫里斯水迷宫(morriswatermaze)(mwm)测试表现。在短暂的treg消耗后，相对于ad-tg对照，ad-tg小鼠在mwm的(c)获得、(d)探索和(e)逆转阶段中显示更好的空间学习/记忆表现(n＝7-9只/组；两因素重复测量方差分析，之后是用于个体对比较的邦弗朗尼(bonferroni)事后分析；*，对于总体获得、探索和逆转，p<0.05)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图7显示了与年龄匹配的wt对照组相比，从6月龄和12月龄app/ps1ad-tg小鼠(阿尔茨海默病小鼠模型(参见材料和方法))分离的cp中通过rt-qpcr测量的ifn-γ的mrna表达水平(n＝5-8只/组；学生t检验)。误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05。
图8a-i显示了在ad-tg小鼠中施用每周一次的乙酸格拉默(glatirameracetate)(ga)的治疗效果。(a)每周ga治疗方案的示意性图示。对于总共4周时期，在第一周期间两次(第1天和第4天)，并且此后每周一次，用ga(100μg)皮下注射小鼠(5月龄)。在最后一次注射后1周(mwm)、1个月(rawm)和2个月(rawm，使用不同的实验空间设置)检查小鼠的认知表现，和海马炎症。图8b-d显示了6周龄的未治疗的ad-tg小鼠和用每周一次的ga治疗的ad-tg小鼠的海马中基因的mrna表达水平，其显示在每周一次的ga治疗的小鼠中，(b)促炎细胞因子(例如tnf-α、il-1β和il-12p40)的降低表达、(c)抗炎细胞因子il-10和tgf-β的升高以及(d)神经营养因子igf-1和bdnf的升高(n＝6-8只/组；学生t检验)。在图8e-g中，用每周一次的ga或媒介物(pbs)治疗ad-tg小鼠(5月龄)，并将其在mwm任务中在6月龄与年龄匹配的wt同窝进行比较。经治疗的小鼠相对于对照，在mwm的获得(e)、探索(f)和反转(g)阶段中显示更好的空间学习/记忆表现(n＝6-9只/组；两因素重复测量方差分析，之后是用于个体对比较的邦弗朗尼事后分析；wt小鼠，黑色圆圈；ad-tg对照，白色圆圈；经治疗的ad-tg，灰色圆圈)。图8h-i显示在最后一次ga注射后1个月(h)或2个月(i)，在rawm任务中相同小鼠的认知表现(n＝6-9只/组；两因素重复测量方差分析，之后是用于个体对比较的邦弗朗尼事后分析)。数据表示至少三次独立实验。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图9a-h显示了在ad-tg小鼠中施用每周一次的ga的进一步治疗效果。a-b显示用每周一次的ga或媒介物(pbs)治疗并在第1周施用方案结束时(在总共两次ga注射后)检查的5xfadad-tg小鼠。与年龄匹配的wt对照相比，在经治疗的6月龄ad-tg小鼠中，cd4+foxp3+脾细胞频率(a)和cp表达ifn-γ的免疫细胞(b；经细胞内染色并在cd45上进行预先门控)的流式细胞术分析(n＝4-6只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯(newman-keuls)事后分析)。(c)在用每周一次的ga或媒介物治疗并且在第1周或第4周的每周一次的ga方案结束时检查的4月龄ad-tg小鼠的cp中，通过rt-qpcr测量的基因icam1、cxcl10和ccl2的mrna表达水平(n＝6-8只/组；单向anova，之后是纽曼-科伊尔斯检验事后分析)。图9d-e显示了每周一次的ga后的6月龄的ad-tg/cx3cr1gfp/+bm嵌合体的脑切片的代表性图像。cx3cr1gfp细胞定位于用每周一次的ga治疗的ad-tg小鼠中的第三脑室(3v；i)的cp、相邻的脑室空间(ii)和侧脑室(lv；iii)的cp(d；比例尺，25μm)。共聚焦z-轴堆叠的代表性正交投影，显示在用每周一次的ga治疗的7月龄ad-tg/cx3cr1gfp/+小鼠的cp中，但不在对照pbs治疗的ad-tg/cx3cr1gfp/+小鼠中，gfp+细胞与髓样细胞标志物cd68共定位(e；比例尺，25μm)。(f)cx3cr1gfp细胞在ga治疗的ad-tg/cx3cr1gfp/+小鼠的脑中在aβ斑附近与髓样细胞标志物iba-1共定位，并且共表达髓样细胞标志物iba-1(比例尺，25μm)。图9g-h显示了从4月龄的wt未治疗的ad-tg小鼠和在每周一次的ga方案的第2周的ad-tg小鼠的海马分离的细胞的代表性流式细胞术图。对cd11b高/cd45高mo-mφ进行门控(g)和定量(h；n＝4-5只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图10a-h描绘了在ad-tg小鼠中施用p300抑制剂(c646)的治疗效果。在图10a-b中，用p300i或媒介物(dmso)将老龄小鼠(18个月)治疗1周，并在停止治疗后一天进行检查。代表性流式细胞术图显示在p300i治疗后，脾中表达ifn-γ的cd4+t细胞的频率(a)和cp中表达ifn-γ的免疫细胞数量(b)的升高。图10c-e显示了接受p300i或媒介物(dmso)达1周并且随后在另外3周后检查的10月龄ad-tg小鼠的脑中aβ斑块负荷的代表性显微图像(c)和定量分析。针对aβ斑块并且通过hoechst核染色对脑进行免疫染色(n＝5只/组；比例尺，250μm)。在海马dg(d)和大脑皮质第5层(e)中对平均aβ斑块面积和斑块数量进行定量(在6μm脑切片中；n＝5-6只/组；学生t检验)。(f)在一期或两期中，将p300i治疗(或作为媒介物的dmso)施用方案给予7月龄ad-tg小鼠的不同组的示意性图示。图10g-h显示了相对于未治疗的ad-tg组，大脑皮质(第5层)的aβ斑块覆盖百分比的变化平均值(g)，以及大脑可溶性aβ1-40和aβ1-42蛋白质水平的平均变化(h)(未治疗组中的aβ1-40和aβ1-42平均水平，分别为90.5±11.2和63.8±6.8pg/mg总部分；n＝5-6只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图11a-d显示ad-tg小鼠中pd-1阻断增加ifn-γ依赖性脉络丛活性。在第1天和第4天用250μg抗-pd-1或对照igg腹膜内注射10月龄ad-tg小鼠，并在第7-10天检查对系统性免疫应答和cp活性的作用。(a-b)在αpd-1或igg治疗的ad-tg小鼠以及未治疗的ad-tg和wt对照组中，cd4+ifn-γ+脾细胞频率(经细胞内染色并且在cd45和tcr-β上进行预先门控)的代表性流式细胞术图(a)和定量分析(b)(n＝4-6只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析；**，在所示的治疗组之间，p<0.01；误差棒表示平均值±s.e.m.)。(c)当与igg治疗的和未治疗的ad-tg对照相比时，在用抗-pd-1治疗的ad-tg小鼠的cp中通过rt-qpcr测量的ifn-g的mrna表达水平，(d)在相同小鼠的cp的rna-seq中富集的go注释术语(n＝3-5只/组；单因素方差分析，之后是纽曼-科伊尔斯事后分析；*，p<0.05)(灰色标度对应p值的以10为底的负对数)。
图12a-b显示pd-1阻断减轻了ad-tg小鼠的认知衰退。在第1天和第4天用250ug的抗-pd-1或对照igg经腹膜内注射10月龄ad-tg小鼠，并在1个月或2个月后检查对病理的作用。(a-b)实验设计方案。单箭头指示治疗的时间点，并且双箭头指示认知测试的时间点。通过rawm学习和记忆任务中每天的平均错误次数所评估的与年龄匹配的wt小鼠和未治疗的ad-tg小鼠相比，抗pd-1和igg治疗的小鼠的认知表现(n＝6-8只/组；两因素重复测量方差分析，之后是用于个体对比较的邦弗朗尼事后检验)。(a)在用抗-pd-1或igg对照进行的1治疗期后ad-tg小鼠在rawm中的表现。(b)单次抗-pd-1治疗期或有1个月间隔的两期对表现的作用。
图13a-d描绘了显示pd-1阻断减轻在10月龄时用抗-pd-1(在1个或2个时程中，如图12a-b中所描绘的)或igg对照治疗且随后在12月龄时进行检查的ad-tg小鼠的脑中aβ斑块负荷和星形胶质细胞增生的ad病理的代表性显微图像(a)以及对aβ斑块负荷和星形胶质细胞增生的定量分析(b、c、d)。针对aβ斑块(红色)、gfap(标记星形胶质细胞增生，绿色)并且通过hoechst核染色对脑进行免疫染色(n＝4-5只/组；比例尺，50μm)。在海马齿状回(dg)和大脑皮质第5层中对aβ斑块面积和斑块数量进行定量，并且在海马中测量gfap免疫反应性(在6μm脑切片中；n＝5-6只/组；学生t检验)。在所有图中，误差棒表示平均值±s.e.m.；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
图14显示了抗-pd-1抗体的不同给药和施用频率对ad-tg小鼠的认知衰退的作用。用抗-pd-1特异性抗体(igg2a抗小鼠pd-1或igg对照(大鼠igg2a))治疗雌性5xfadad转基因小鼠(平均群体年龄为6个月)。抗-pd-1治疗的小鼠在实验的第1天接受500ug抗体的1次注射，或在注射之间有3天间隔的250ug的两次注射。将年龄匹配的野生型(wt)小鼠用作另外的对照组。我们使用辐射臂水迷宫(radialarmwatermaze)(rawm)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。呈现了实验设计。黑色箭头指示治疗的时间点，并且插图指示认知测试的时间点。抗-pd-1治疗的5xfad小鼠–一次注射(n＝7)或两次注射(n＝11)、igg2a治疗的5xfad小鼠(n＝10)和wt(n＝14)对照的rawm表现；两因素重复测量方差分析和杜奈特事后检验(dunnettpost-test))。误差棒表示平均值±s.e.m.；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，抗-pd-1治疗的小鼠(1次注射)相对于igg治疗的对照。
图15a-c显示了重复施用抗-pd-1抗体对ad-tg小鼠的认知衰退的作用。用抗-pd-1特异性抗体(igg2a抗小鼠pd-1)或igg对照(大鼠igg2a)，每月一次在重复治疗期中治疗雄性5xfadad转基因小鼠。第一次注射在3月龄，第二次注射在4月龄，并且第三次注射在5月龄。在实验设计的方案中指示剂量(a)。将年龄匹配的野生型(wt)小鼠用作另外的对照组。我们在两个不同的时间点(5月龄(b)和6月龄(c))使用辐射臂水迷宫(rawm)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。呈现了实验设计。黑色箭头指示治疗的时间点，并且插图指示认知测试的时间点。抗-pd-1治疗的5xfad小鼠(n＝7；空心圆圈)、igg2a治疗的5xfad小鼠(n＝9；空心正方形)和wt(n＝8)对照(实心圆圈)的rawm表现；两因素重复测量方差分析和杜奈特事后检验)。误差棒表示平均值±s.e.m.；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，抗-pd-1治疗的小鼠相对于igg治疗的对照。
具体实施方式
免疫检查点机制(包括通过抑制性受体对激活的t细胞应答性和效应性功能的细胞内在下调)维持全身性免疫稳态和自身免疫耐受(joller等，2012；pardoll，2012)。近年来，阻断这些免疫检查点，例如程序性死亡-1(pd-1)途径(francisco等，2010)已显示出显著的抗肿瘤功效，突出显示了释放免疫系统在对抗各种恶性肿瘤中的能力的潜力。最近，显示(wo2015/136541；baruch等，2016)向阿尔茨海默病的动物模型施用抗-pd-1抗体导致aβ的清除、认知衰退的逆转，并且与神经炎性应答的消退相关。
因此，系统性免疫抑制干扰抵抗ad病理的能力，并且通过解除对全身性免疫系统的限制，可减轻ad病理。
本发明提供用于治疗不包括自身免疫性神经炎性疾病复发缓解型多发性硬化(rrms)在内的中枢神经系统(cns)的疾病、病症、病况或损伤的方法，所述方法包括向有需要的个体施用活性剂，所述活性剂通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起系统性免疫抑制水平的降低，其中所述活性剂是通过包括至少两个疗程的给药方案施用的，每个疗程依次包括治疗期，之后是非治疗的间隔期并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：icos-b7rp1、t细胞激活的v结构域ig抑制剂(vista)、b7-cd28样分子、cd40l-cd40、cd28-cd80、cd28-cd86、b7h3、b7h4、b7h7、btla-hvem、cd137-cd137l、ox40l、cd27-cd70、干扰素基因刺激蛋白(sting)、t细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域(tigit)以及a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸。
在另一方面，本发明涉及通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起个体中系统性免疫抑制水平的降低的活性剂，或包含所述活性剂的药物组合物，用于治疗不包括自身免疫性神经炎性疾病复发缓解型多发性硬化(rrms)在内的cns的疾病、病症、病况或损伤的方法，其中所述药物组合物用于通过包括至少两个疗程的给药方案实施，每个疗程依次包括治疗期，之后是非治疗的间隔期；并且所述一个或多个免疫检查点选自由以下组成的组：icos-b7rp1、vista、b7-cd28样分子、cd40l-cd40、cd28-cd80、cd28-cd86、b7h3、b7h4、b7h7、btla-hvem、cd137-cd137l、ox40l、cd27-cd70、sting、tigit以及a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸。
在某些实施方案中，调整给药方案，使得系统性免疫抑制的水平短暂降低。
如本文所用的术语“治疗”是指获得期望的生理效应的手段。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的症状来说，该效果可以是治疗性的。该术语是指抑制该疾病，即阻止或减缓其发展；或改善该疾病，即引起该疾病的消退。
术语“非治疗期”在本文中与术语“无治疗时期”可互换使用，并且是指其中未将活性剂施用于正在治疗的个体的时期。
如本文所用的术语调节性t细胞或效应t细胞的“系统性存在”是指在循环免疫系统(即血液、脾和淋巴结)中存在调节性t细胞或效应t细胞(如通过它们的水平或活性所测量)。在免疫学领域众所周知的事实是，脾中的细胞群体谱反映在血液中的细胞群体谱(zhao等，2007)。
本治疗适用于显示系统性免疫抑制升高的患者以及未显示这种升高的患者。有时，根据本发明的需要治疗的个体具有一定水平的外周免疫抑制，其反映为循环中treg的升高的频率或数量，和/或它们的增强的功能活性和/或产生ifnγ的白细胞的降低和/或降低的白细胞响应于刺激的增殖。treg的频率或数量的升高可以总数计或占总cd4细胞的百分比计。例如，根据本发明已发现，与野生型小鼠相比，阿尔茨海默病的动物模型具有更高的foxp3占cd4细胞的频率。然而，即使在所述个体中，系统性treg细胞的水平不升高，它们的功能活性不增强，产生ifnγ的白细胞的水平不降低，或者响应于刺激的白细胞增殖不降低，降低系统性免疫抑制的水平或活性的本发明方法在治疗不包括自身免疫性神经炎性疾病rrms在内的cns的疾病、病症、病况或损伤方面也是有效的。重要的是，所述系统性免疫抑制还可涉及除treg之外的其他免疫细胞类型，例如髓源性抑制细胞(mdsc)(gabrilovich和nagaraj，2009)。
系统性免疫抑制的水平可通过本领域普通技术人员熟知的各种方法检测。例如，可通过外周血单核细胞或t淋巴细胞的流式细胞术分析来测量treg的水平，所述t淋巴细胞针对treg的细胞表面标志物或核细胞内标志物免疫染色(chen和oppenheim，2011)，所述淋巴细胞针对cd45、tcr-β或cd4标记物进行免疫染色，并测量特异性结合所述细胞的抗体的量。treg的功能活性可通过各种测定来测量；例如，胸苷掺入测定正被普遍使用，其中通过[3h]胸苷掺入或使用能够进入细胞的cfse(5-(和6)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯测量对cd4+cd25-t细胞(常规t细胞)的抗-cd3mab刺激的增殖的抑制；细胞分裂被测量为cfse的荧光强度的连续减半)。本领域技术人员可使用本领域已知的方法容易地评估产生ifnγ的白细胞的数量或它们的活性或它们的增殖能力；例如，产生ifnγ的白细胞的水平可通过以下方式来测量：在短的体外刺激和高尔基停止(golgi-stop)、并且通过ifnγ细胞内染色(使用例如bdbiosciencescytofix/cytopermtm)固定/透化试剂盒)进行免疫染色后，进行外周血单核细胞的流式细胞术分析，收集这些细胞的条件培养基并使用elisa对所分泌的细胞因子的水平进行定量，或比较条件培养基中不同细胞因子(例如il2/il10、il2/il4、infγ/tgfβ等)的比率。mdsc在人外周血中的水平可由本领域技术人员例如通过使用dr-/lin-/cd11b+、dr-/lin-/cd15+、dr-/lin-/cd33+和dr(-/低)/cd14+细胞的频率的流式细胞术分析来容易地评估，如所述(kotsakis等，2012)。
在人中，当循环中treg的总数比健康对照群体中高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高，总cd4+细胞中treg细胞的百分比比健康对照群体中升高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高，或者treg的功能活性比健康对照群体中升高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高时，外周/系统性免疫抑制可被认为升高。或者，当产生ifnγ的白细胞的水平或它们的活性相对于健康对照群体的水平或活性降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；或白细胞响应于刺激的增殖相对于健康对照群体的增殖降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％时，外周/系统性免疫抑制可被认为升高。
当在向个体施用药剂后，该个体的循环中treg的总数与施用该药剂之前的水平相比降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，总cd4+细胞中treg细胞的百分比相对于健康对照群体下降了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或者treg的功能活性与施用该药剂之前的水平相比降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％时，该药剂可被认为是引起系统性免疫抑制水平的降低的药剂。或者，当在个体施用药剂后，产生ifnγ的白细胞的总数或它们的活性增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高；或可引起系统性免疫抑制水平降低的药剂；或白细胞响应于刺激的增殖相对于健康对照群体的增殖增加了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或更高时，该药剂可被认为是引起系统性免疫抑制水平的降低的药剂。
在某些实施方案中，活性剂通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制(例如通过阻断一个或多个免疫检查点)来引起系统性免疫抑制水平的降低。
在某些实施方案中，活性剂引起所述系统性免疫抑制水平的降低，并由此引起效应t细胞的系统性存在或活性的增加。
可被操纵以解除系统性免疫抑制的检查点在本文中被称为一对免疫检查点受体和其天然配体或两个配偶体中的任一个。例如，具有两个已知配体的pd1在本文中被称为"pd1-pdl1"或"pd1-pdl2"，而其配体尚未被鉴别的b7h3被简称为"b7h3"。
在某些实施方案中，可根据本发明使用的活性剂可选自由以下组成的组：(i)抗体，例如人源化抗体；人抗体；抗体的功能片段；单结构域抗体，例如纳米抗体；重组抗体；和单链可变片段(scfv)(ii)抗体模拟物，例如亲和体分子；affilin；粘合素(affimer)；affitin；α体；抗运载蛋白；avimer；darpin；fynomer；kunitz结构域肽；和单体(monobody)；(iii)适体；和(iv)小分子抑制剂。
抗体模拟物的非限制性示例呈现于表1中：
表1.抗体模拟物
[1]nygrenpa(2008年6月)；[2]ebersbach等(2007)；[3]johnson等(2012)；[4]krehenbrink等(2008)；[5]desmet等(2014)；[6]skerraa(2008)；[7]silverman等(2005)；[8]stumpp等(2008)'[9]grabulovski等(2007)；[10]nixon等(2006)；[11]koide等(2007)。
适体是结合特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。
在某些实施方案中，可根据本发明使用的活性剂可选自由以下组成的组：
(i)选自由以下组成的组的抗体：(a)抗-icos；(b)抗-b7rp1；(c)抗-vista；(d)抗-cd40；(e)抗-cd40l；(f)抗-cd80；(g)抗-cd86；(h)抗-b7-h3；(i)抗-b7-h4；(j)b7-h7；(k)抗-btla；(l)抗-hvem；(m)抗-cd137；(n)抗-cd137l；(o)抗-ox40l；(p)抗-cd-27；(q)抗-cd70；(r)抗-sting；(s)抗-tigit；和(t)(a)到(s)的任一组合；
(ii)结合佐剂的(a)到(s)的任一组合；
(iii)选自由以下组成的组的小分子：(a)腺苷a1受体拮抗剂；(b)腺苷a2a受体；和(c)a3受体拮抗剂；
(iv)(a-c)和(i)(a-s)的任一组合；和
(v)(i)到(iv)的任一组合。
在某些实施方案中，可将上述抗体以例如如下剂量向人施用：约0.1mg/kg-20mg/kg、0.1mg/kg-15mg/kg、0.1mg/kg-10mg/kg、0.1mg/kg-5mg/kg、0.2mg/kg-20mg/kg、0.2mg/kg-15mg/kg、0.2mg/kg-10mg/kg、0.2mg/kg-6mg/kg、0.2mg/kg-5mg/kg、0.3mg/kg-20mg/kg、0.3mg/kg-15mg/kg、0.3mg/kg-10mg/kg、0.3mg/kg-5mg/kg、1mg/kg-20mg/kg、1mg/kg-15mg/kg、1mg/kg-10mg/kg、1mg/kg-5mg/kg、1.5mg/kg-20mg/kg、1.5mg/kg-15mg/kg、1.5mg/kg-10mg/kg、1.5mg/kg-6mg/kg或1.5mg/kg-5mg/kg。
在某些实施方案中，腺苷a1受体拮抗剂可以是psb36(1-丁基-8-(六氢-2,5-甲桥并环戊二稀(methanopentalen)-3a(1h)-基)-3,7-二氢-3-(3-羟基丙基)-1h嘌呤-2,6-二酮)；腺苷a2a受体拮抗剂可以是sch58261(5-氨基-7-(2-苯乙基)-2-(2-呋喃基)-吡唑并(4,3-e)-1,2,4-三唑并[1,5-c)嘧啶)、syn115(4-羟基-n-[4-甲氧基-7-(4-吗啉基)-2-苯并噻唑基]-4-甲基-1-哌啶甲酰胺)、fsptp(还被称为sch58261(5-氨基-7-[2-(4-氟磺酰基)苯乙基]-2-(2-呋喃基)-吡唑并[4,3-ε]-1,2,4-三唑并[1,5-c]嘧啶)、sch442416(2-(2-呋喃基)-7-[3-(4-甲氧基苯基)丙基]-7h-吡唑并[4,3-e][1,2,4]三唑并[1,5-c]嘧啶-5-胺)或zm241385(还被称为tozadenant(4-羟基-n-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺；并且a3受体拮抗剂可以是mrs3777(2-苯氧基-6-(环己基氨基)嘌呤半草酸酯)。
如上文所述，所述活性剂是通过包括至少两个疗程的给药方案来施用的，每个疗程依次包括治疗期，之后是非治疗的间隔期。给药方案可以多种方式确定。例如，可通过单个地监测产生ifn-γ的白细胞的水平或活性或者白细胞响应于刺激的增殖速率，并根据经验和个人情况调节如由监测结果所确定的治疗期、治疗频率和间隔期，将免疫抑制水平调整到正在治疗的每个患者的期望水平(个体化用药)。
因此，治疗期可包括向个体施用活性剂或药物组合物，并且将所述治疗时程至少维持直到产生ifn-γ的白细胞的系统性存在或水平或白细胞响应于刺激的增殖速率上升到高于参考值，在所述间隔期的期间暂停施用，并且只要所述水平高于所述参考值，就维持所述间隔期，其中所述参考值选自(a)在所述施用之前从所述个体获得的最新血液样品中测量的产生ifn-γ的白细胞的系统性存在或活性的水平或者白细胞响应于刺激的增殖速率；或(b)患有cns的疾病、病症、病况或损伤的个体群体所特征性的产生ifn-γ的白细胞的系统性存在或活性的水平或者白细胞响应于刺激的增殖速率。
治疗期和间隔期的长度可由医生在针对某一患者群体的临床试验中确定，然后一致地应用于该患者群体，而无需基于个人监测免疫抑制的水平。
在某些实施方案中，治疗期包括向所述个体施用所述活性剂，并且将所述治疗期至少维持直到所述活性剂的系统性存在达到治疗水平，在所述间隔期的期间暂停所述施用，并且只要所述水平高于所述治疗水平的约95％、90％、80％、70％、60％或50％，就维持所述间隔期。如本文所用，术语“治疗水平”是指用于在已知疗法(例如癌症疗法)(参见上文)中阻断免疫检查点的药物的普遍接受的系统水平。
在某些实施方案中，治疗期可以是单次施用，或者其可包括在1天到4周之间(例如1天、2天或3天或1周到4周之间)的过程中给予的多次施用。例如，治疗期可包括均在一周内给予的两次施用，例如在第一次施用的1天、2天、3天、4天、5天或6天后给予的第二次施用。作为另一示例，治疗期可包括均在一周内给予的三次施用，例如在前一次施用的1天、2天或3天后给予。作为另一示例，治疗期可包括均在两周内给予的三次施用，例如在前一次施用的1天、2天、3天、4天或5天后给予。作为另一示例，治疗期可包括均在两周内给予的四次施用，例如在前一次施用的1天、2天、3天或4天后给予。作为另一示例，治疗期可包括均在三周内给予的四次施用，例如在前一次施用的1天、2天、3天、4天、5天或6天后给予。作为另一示例，治疗期可包括均在三周内给予的五次施用，例如在前一次施用的1天、2天、3天、4天或5天后给予。
在某些实施方案中，非治疗的间隔期可以是一周到六个月，例如二到四周、三到四周、两周到六个月长、3周到六个月长且特别是2周、3周或4周长。在某些实施方案中，非治疗的间隔期可以是1到2个月长、1到3个月长或2到3个月长。
在治疗期中，活性剂或药物组合物的施用可以是单次施用或重复施用，例如活性剂或药物组合物可仅被施用一次，然后间隔紧随其后，或者可每天一次、或每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次或每六天一次、或每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用。这些频率适用于任何活性剂，可基于本领域常用的实践，并且最终可由医师在临床试验中确定。或者，可根据活性剂的性质调整治疗期中重复施用的频率，其中例如小分子可每天一次施用，并且抗体可每3天一次施用。应当理解的是，当在治疗期的期间以相对较低的频率(例如在一个月的治疗期的期间每周一次或在六个月的治疗期的期间每月一次)施用药剂时，该治疗期之后是非治疗间隔期，该非治疗间隔期的长度长于在该治疗期的期间重复施用之间的时期(即，在该实施例中分别长于一周或一个月)。在该实施例中在治疗期的期间，施用之间的一周或一个月的暂停不被认为是间隔期。
可根据施用频率调节治疗期和间隔期的长度，使得例如每3天一次施用活性剂的频率可导致6天或9天的治疗期和相应开始的间隔期。
如果治疗期由单次施用组成，则给药方案由间隔的长度确定，使得单次施用之后是在下一个单次施用治疗期之前的7天、8天、9天、10天、14天、18天、21天、24天或28天或更长的间隔。具体地说，给药方案由分散在2周、3周或4周之非治疗间隔的单次施用组成。另外，给药方案可由分散在2到4周、2到3周或3到4周的非治疗间隔的单次施用组成。
如果治疗期由多次施用组成，给药由间隔的长度确定，使得在一周内给予的多次施用之后是下一个多次施用治疗期之前的7天、10天、14天、18天、21天、24天或28天或更长的间隔。具体地说，给药方案可由分散在2周或3周或4周的非治疗间隔的在一周内给予的多次施用组成。另外，给药方案可由分散在2到4周、2到3周或3到4周的非治疗间隔的在一周内给予的多次施用组成。
作为另一示例，给药方案可包括在两周内给予的多次施用，之后是在下一个多次施用治疗期之前的2周、3周或1个月、2个月、3个月或4个月或更长的间隔。具体地说，给药方案可由分散在1个月、2个月、3个月或4个月的非治疗间隔的、在两周内给予的多次施用组成。另外，给药方案可由分散在1到2个月、1到3个月、1到4个月、2到3个月、2到4个月或3到4个月非治疗间隔的、在两周内给予的多次施用组成。
作为另一示例，给药方案可包括在三周内给予的多次施用，之后是在下一个多次施用治疗期之前的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月或更长时间。具体地说，给药方案可由分散在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月的非治疗间隔的、在三周内给予的多次施用组成。另外，给药方案可由分散在1到2个月、1到3个月、1到4个月、1到5个月、1到6个月、2到3个月、2到4个月、2到5个月、2到6个月、3到4个月、3到5个月、3到6个月、4到5个月、4到6个月或5到6个月的非治疗间隔的、在三周内给予的多次施用组成。
当然，设想从某一方案开始并被另一方案替代的灵活的给药方案。例如，治疗期(每个治疗期包括间隔3天的2个单次施用，在治疗期之间有例如1周的间隔)可在认为适当时由以下给药方案替代：包括由例如2周、3周或4周间隔分开的单次施用的治疗期的给药方案。作为另一示例，治疗期(每个治疗期包括间隔7天的2个单次施用，在治疗期之间有例如2周的间隔)可在认为适当时由以下给药方案替代：，包括由例如2周、3周、4周、5周或6周间隔分开的单次施用的治疗期的给药方案。作为另一示例，治疗期(每个治疗期包括间隔3天的3个单次施用，在治疗期之间有例如2周的间隔)可在认为适当时由以下给药方案替代：包括由例如2周、3周、4周、5周或6周间隔分开的单次施用的治疗期的给药方案。
在任何情况下，给药方案(即治疗期和间隔期的长度)被调整成使得免疫抑制水平的降低(例如通过由个体中调节性t细胞的系统性存在或活性水平的降低或者产生ifn-γ的白细胞的系统性存在或活性水平的增加所测量)是短暂的。
根据本发明的方法、活性剂或药物组合物可用于治疗cns的疾病、病症或病况，其为选自以下的神经变性疾病、病症或病况：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿氏病、原发性进行性多发性硬化；继发性进行性多发性硬化、皮质基底节变性(corticobasaldegeneration)、瑞特综合征(rettsyndrome)、选自由年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性组成的组的视网膜变性病症；前部缺血性视神经病变；青光眼；葡萄膜炎；抑郁症；创伤相关性应激或创伤后应激障碍、额颞叶痴呆、路易体痴呆(lewybodydementias)、轻度认知损伤、后部皮质萎缩、原发性进行性失语或进行性核上性麻痹。在某些实施方案中，cns的病况是年龄相关性痴呆。
在某些实施方案中，cns的病况是阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿氏病。
在某些实施方案中，阻断选自icos-b7rp1、t细胞激活的v-结构域ig抑制剂(vista)、b7-cd28样分子、cd40l-cd40、cd28-cd80、cd28-cd86、b7h3、b7h4、b7h7、btla-hvem、cd137-cd137l、ox40l、cd27-cd70、sting、tigit以及a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸的免疫检查点之一的上述活性剂中的每一种(例如针对所述免疫检查点的两种配偶体之一的抗体)用于治疗选自以下的神经变性疾病、病症或病况中的任一种：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿氏病、原发性进行性多发性硬化；继发性进行性多发性硬化、皮质基底节变性、瑞特综合征、选自由年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性组成的组的视网膜变性病症；前部缺血性视神经病变；青光眼；葡萄膜炎；抑郁症；创伤相关性应激或创伤后应激障碍、额颞叶痴呆、路易体痴呆、轻度认知损伤、后部皮质萎缩、原发性进行性失语或进行性核上性麻痹。包括使用这些活性剂中的任一种的对这些疾病中的任一种的治疗可根据上述方案进行。
根据本发明的方法、活性剂和药物组合物可进一步用于治疗选自以下的cns损伤：脊髓损伤、闭合性头部损伤、钝性创伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血、视神经损伤、心肌梗塞、有机磷酸酯中毒和由肿瘤切除引起的损伤。
在某些实施方案中，阻断选自icos-b7rp1、t细胞激活的v-结构域ig抑制剂(vista)、b7-cd28样分子、cd40l-cd40、cd28-cd80、cd28-cd86、b7h3、b7h4、b7h7、btla-hvem、cd137-cd137l、ox40l、cd27-cd70、sting、tigit以及a2ar-腺苷和吲哚胺-2,3-双加氧酶(ido)-l-色氨酸的免疫检查点之一的上述活性剂中的每一种(例如针对所述免疫检查点的两种配偶体之一的抗体)用于治疗选自以下的cns损伤：脊髓损伤、闭合性头部损伤、钝性创伤、穿透性创伤、出血性中风、缺血性中风、脑缺血、视神经损伤、心肌梗塞、有机磷酸酯中毒和由肿瘤切除引起的损伤。包括使用这些活性剂中的任一种的对这些损伤中的任一种的治疗可根据上述方案进行。
如上所述，发明人已发现本发明改善了模仿阿尔茨海默病的小鼠的认知功能。因此，所述方法、活性剂和药物组合物可用于改善cns运动和/或认知功能，例如用于缓解年龄相关的认知功能丧失，所述年龄相关的认知功能丧失可发生在无诊断疾病的个体以及罹患神经变性疾病的人中。此外，所述方法、活性剂和药物组合物可用于缓解由急性应激或创伤性事件引起的认知功能丧失。上文提到的认知功能可包括学习、记忆或两者。
应当强调的是，发明人在疾病表现的各个阶段观测到模仿阿尔茨海默病的小鼠(5xfadad-tg小鼠)的认知功能的改善并对其进行了表征；疾病病理的早期和晚期进展阶段均可通过所述治疗来减轻。5xfadad-tg小鼠在2.5月龄时开始展示出大脑斑块病理，并在5月龄时展显出认知缺陷(oakley等，2006)。值得注意的是，尽管在下面的实施例2中，本发明人描述了在6月龄的5xfad小鼠中的治疗效果，但在实施例5中，他们表征了在11月龄和12月龄的5xfad小鼠——该模型中淀粉样蛋白β斑块沉积和认知缺陷的极度进展阶段——中的治疗效果。因此预期所提出的发明将与疾病进展的不同阶段的患者相关，例如阶段1-轻度/早期(持续2-4年)；阶段2-中度/中期(持续2-10年)；和第三阶段-严重/晚期(持续1-3年以上)。
如本文所用的术语“cns功能”尤其是指接受和处理感觉信息，思考，学习，记忆，感知，产生和理解语言，控制运动功能以及听觉和视觉反应，维持平衡和均衡，运动协调，感觉信息的传导，控制例如呼吸、心率、消化的自主功能。
术语“认知”、“认知功能”和“认知表现”在本文中可互换使用，并且涉及任何精神过程或状态，其涉及但不限于学习、记忆、图像产生、思考、意识、推理、空间能力、言语和语言技能、语言获取和判断关注的能力。认知在脑的多个区域(例如海马、皮质和其他脑结构)中形成。然而，假设长期记忆至少部分地储存在皮质中，并且已知感觉信息被驻留在岛叶皮质内的特定皮质结构(即味觉皮质)获取、巩固并检索。
在人类中，认知功能可通过任何已知的方法来测量，例如但不限于，通过临床总体印象变化量表(clinicalglobalimpressionofchangescale)(cibic-+量表)；简易精神状态检查(minimentalstateexam)(mmse)；神经心理学调查表(neuropsychiatricinventory)(npi)；临床痴呆评定量表(clinicaldementiaratingscale)(cdr)；剑桥神经心理测试自动化组合(cambridgeneuropsychologicaltestautomatedbattery)(cantab)或sandoz老年临床评估(sandozclinicalassessment-geriatric)(scag)。认知功能还可使用例如正电子发射断层摄影(pet)、功能性磁共振成像(fmri)、单光子发射计算机断层摄影(spect)的成像技术或允许测量脑功能的任何其他成像技术来间接测量。
影响患者认知的一个或多个过程的改善将意味着所述患者的认知功能的改善，因此在某些实施方案中改善认知包括改善学习、可塑性和/或长期记忆。术语"改善"和"增强"可互换使用。
术语"学习"涉及获取或获得新的、或修改和增强的、现有的知识、行为、技能、价值或偏好。
术语"记忆"涉及对信息进行编码、储存和检索的过程。记忆有三种可区分的类别：感觉记忆、短期记忆和长期记忆。
术语"长期记忆"是长时期或无限期地保持信息的能力。长期记忆包括两个主要分部(division)：外显记忆(陈述性记忆)和内隐记忆(非陈述性记忆)。长期记忆是通过记忆巩固来实现的，记忆巩固是在初始获取之后稳定记忆痕迹的一系列过程。巩固被区分为两个具体的过程：突触巩固，其发生在学习后的前几个小时内；和系统巩固，其中海马依赖性记忆在数周到数年的时期内变得独立于海马。
在再一方面，本发明提供了用于降低诊断患有阿尔茨海默病的患者的aβ斑块负荷的方法，其包括向所述患者施用如上文所定义的活性剂或药物组合物，所述活性剂或药物组合物通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起系统性免疫抑制水平的降低。
在又一方面，本发明提供了用于降低诊断患有阿尔茨海默病的患者的海马神经胶质增生的方法，其包括向所述患者施用如上文所定义的活性剂或药物组合物，所述活性剂或药物组合物通过解除由一个或多个免疫检查点施加到免疫系统的限制来引起系统性免疫抑制水平的降低。
根据本发明使用的药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。一种或多种载体必须在与组合物的其他成分相容的意义上是"可接受的"，且对其接受者无害。
载体、施用方式、剂型等的以下例证被列为可从中选择用于本发明的载体、施用方式、剂型等的已知可能性。然而，本领域普通技术人员将会理解，应首先测试所选的任何给定制剂和施用模式，以确定其达到期望的结果。
施用方法包括但不限于胃肠外，例如静脉内、腹膜内、肌内、皮下、粘膜(例如口服、鼻内、口含、阴道、直肠、眼内)、鞘内、局部和真皮内途径。施用可以是系统的或局部的。
术语“载体”是指与活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药物组合物中的载体可包括粘合剂，例如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone或povidone))、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，例如海藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，例如硬脂酸镁或月桂基硫酸钠；和助流剂，例如胶体二氧化硅。
对于口服施用，药物制剂可呈液体形式，例如溶液、糖浆或混悬剂，或者可呈现为用于在使用前用水或其他适合的媒介物重构的药物产品。此类液体制剂可通过常规手段利用例如以下的药学上可接受的添加剂制备：悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯或分馏的植物油)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。药物组合物可呈例如通过常规手段利用例如以下的药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式：粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域公知的方法包衣。
用于口服施用的制剂可被适当地配制以给予活性化合物的受控释放。
对于口含施用，所述组合物可呈以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
所述组合物可被配制用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以单位剂量形式(例如在安瓿中或在多剂量容器中)与添加的防腐剂一起呈现。所述组合物可呈例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈粉末形式，以供在使用前用适合的媒介物(例如无菌的无热原水)重构。
所述组合物还可被配制成直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，其例如含有常规栓剂基质，例如可可脂或其他甘油酯。
对于吸入施用，根据本发明使用的组合物以来自加压包装或喷雾器的气雾形式，使用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体，被方便地递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供递送计量量的阀来确定。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药筒可配制为容纳所述化合物和适合的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
待用于人使用的活性成分的剂量的确定基于本领域中常用的实践，并且将由医师在临床试验中最终确定。可基于下文所公开的体内实验证据，使用已知的规则(例如reagan-show等(2007)重新审视的从动物到人研究的剂量转换(dosetranslationfromanimaltohumanstudiesrevisited).thefasebjournal22:659-661)计算向人施用的预期近似当量剂量。根据该范例，成人当量剂量(mg/kg体重)等于给予小鼠的剂量(mg/kg体重)乘以0.081。
现在将通过以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例
材料和方法
rna纯化、cdna合成和定量实时pcr分析.利用tri试剂(molecularresearchcenter)提取海马齿状回(dg)的总rna，并使用rneasy试剂盒(qiagen)将其从裂解物中纯化。使用rnamicroprep试剂盒(zymoresearch)提取脉络丛的总rna。使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将mrna(1μg)转化成cdna。使用基于荧光的定量实时pcr(rt-qpcr)测定特定mrna的表达。使用fast-sybrpcrmastermix(appliedbiosystems)进行rt-qpcr反应。使用标准曲线法以一式三份对每种样品进行定量反应。选择肽基脯氨酰异构酶a(ppia)作为参考(持家)基因。扩增循环为95℃持续5s，60℃持续20s，和72℃持续15s。在测定结束时，构建解链曲线以评价反应的特异性。对于ifn-γ和ppia基因分析，根据制造商的方案(preampmastermixkit；appliedbiosystems)，利用非随机pcr引物在14个pcr循环中预扩增cdna，由此增加随后的实时pcr分析的灵敏度。根据制造商的说明书(appliedbiosystems)使用taqmanrt-qpcr确定mrna表达。使用stepone软件v2.2.2(appliedbiosystems)进行并分析所有rt-qpcr反应。使用以下taqmanassays-on-demandtm探针：mm02342430_g1(ppia)和mm01168134_m1(ifn-γ)。
对于检查的所有其他基因，使用以下引物：
ppia正向5'-agcatacaggtcctggcatcttgt-3'(seqidno:33)和反向5'-caaagaccacatgcttgccatcca-3'(seqidno:34)；
icam1正向5'-agatcacattcacggtgctggcta-3'(seqidno:35)和反向5'-agctttgggatggtagctggaaga-3'(seqidno:36)；
vcam1正向5'-tgtgaagggattaacgaggctgga-3'(seqidno:37)和反向5'-ccatgtttcgggcacatttccaca-3'(seqidno:38)；
cxcl10正向5'-aactgcatccatatcgatgac-3'(seqidno:39)和反向5'-gtggcaatgatctcaacac-3'(seqidno:40)；
ccl2正向5'-catccacgtgttggctca-3'(seqidno:41)和反向5'-gatcatcttgctggtgaatgagt-3'(seqidno:42)；
tnf-γ正向5'-gcctcttctcattcctgctt-3'(seqidno:43)reversectcctccacttggtggtttg-3'(seqidno:44)；
il-1β正向5'-ccaaaagatgaagggctgctt-3'(seqidno:45)和反向5'-tgctgctgcgagatttgaag-3'(seqidno:46)；
il-12p40正向5'-gaagttcaacatcaagagca-3'(seqidno:47)和反向5'-catagtccctttggtccag-3'(seqidno:48)；
il-10正向5'-tgaattccctgggtgagaagctga-3'(seqidno:49)和反向5'-tggccttgtagacaccttggtctt-3'(seqidno:50)；
tgfβ2正向5'-aattgctgccttcgccctctttac-3'(seqidno:51)和反向5'-tgtacaggctgaggactttggtgt-3'(seqidno:52)；
igf-1正向5'-ccggaccagagaccctttg(seqidno:53)和反向5'-cctgtgggcttgttgaagtaaaa-3'(seqidno:54)；
bdnf正向5'-gatgctcagcagtcaagtgccttt-3'(seqidno:55)和反向5'-gacatgtttgcggcatccaggtaa-3'(seqidno:56)；
免疫组织化学.对石蜡包埋的切片小鼠(6μm厚)和人(10μm厚)脑进行组织加工和免疫组织化学测定。对于人icam-1染色，使用一级小鼠抗-icam(1:20abcam；ab2213)抗体。用3％h2o2将载玻片孵育10min，并且使用二级生物素缀合的抗小鼠抗体，之后用vectastainabc试剂盒(vectorlaboratories)进行生物素/抗生物素蛋白的扩增。随后，施加3,3’-二氨基联苯胺(dab底物)(zytomed试剂盒)；将载玻片脱水并用基于二甲苯的封固溶液封固。对于组织染色，在组织切除和固定之前用pbs经心脏灌注小鼠。在解剖显微镜(stemidv4；zeiss)下从脑的侧脑室、第三脑室和第四脑室分离cp组织。对于全组织cp染色，在4℃用2.5％多聚甲醛(pfa)将组织固定1小时，随后转移到含有0.05％叠氮化钠的pbs中。在染色之前，将解剖的组织用pbs洗涤并在室温下阻断(20％马血清，0.3％tritonx-100和pbs)1h。将用一级抗体(在含有2％马血清和0.3％tritonx-100的pbs中)或二级抗体进行的全组织染色在室温下进行1h。每个步骤之后在pbs中洗涤三次。将组织施加到载玻片，用immu-mount(9990402，来自thermoscientific)固定，并用盖玻片密封。对于切片的脑的染色，应用两种不同的组织制备方案(石蜡包埋或被显微切片的自由浮动的切片)，如先前所述(baruch等，2013；kunis等，2013)。使用以下一级抗体：小鼠抗-aβ(1:300,covance，编号sig-39320)；兔抗-gfp(1:100,mbl，编号598)；大鼠抗-cd68(1:300,ebioscience，编号14-0681)；大鼠抗-icam-1(1:200,abcam，编号ab2213)；山羊抗-gfp(1:100,abcam，编号ab6658)；兔抗-iba-1(1:300,wako，编号019-19741)；山羊抗-il-10(1:20,r&dsystems，编号af519)；大鼠抗-foxp3(1:20,ebioscience，编号13-5773-80)；兔抗-cd3(1:500,dako，编号is503)；小鼠抗-zo-1、小鼠抗-e-钙黏蛋白(cahedrin)和兔抗-密封蛋白-1(全部为1:100,invitrogen，编号33-9100、编号33-4000、编号51-9000)；兔抗-gfap(1:200,dako，编号z0334)。二级抗体包括：cy2/cy3/cy5-缀合的驴抗-小鼠/山羊/兔/大鼠抗体(1:200；全部来自jacksonimmunoresearch)。将载玻片暴露于hoechst核染色(1:4000；invitrogenprobes)1min。两种阴性对照被常规用于免疫染色程序，即用同种型对照抗体染色、之后用二级抗体染色，或用单独的二级抗体染色。对于foxp3细胞内染色，使用retreivagen试剂盒(编号550524，编号550527；bdpharmingentm)进行从石蜡包埋载玻片的抗原修复。使用荧光显微镜(e800；nikon)或激光扫描共焦显微镜(carlzeiss公司)进行显微分析。荧光显微镜装配有数字照相机(dxm1200f；nikon)，以及20×na0.50或40×na0.75物镜(planfluor；nikon)。共焦显微镜装配lsm510激光扫描能力(三种激光器：ar488、hene543和hene633)。使用获取软件(nis-elements，f3[nikon]或lsm[carlzeiss公司])对后固定的组织进行记录。对于染色强度的定量，使用imagej软件(nih)测量总细胞和背景染色，并且计算特异性染色的强度，如先前所述(burgess等，2010)。使用photoshopcs613.0(adobe)对图像进行裁剪、合并和优化，并使用illustratorcs515.1(adobe)进行排列。
人cp的石蜡包埋切片.在经适当的同意和伦理委员会批准(tw220)的情况下从oxfordbrainbank(以前被称为thomaswillisoxfordbraincollection(twobc))获得年轻和年长的死后非cns疾病个体以及ad患者的人脑切片。涉及这些部分的实验经魏茨曼科学研究所生物伦理委员会(weizmanninstituteofsciencebioethicscommittee)批准。
流式细胞术、样品制备和分析.用pbs经心脏灌注小鼠，并如前所述(baruch等，2013)处理组织。将脑解剖，并在解剖显微镜(stemidv4；zeiss)下在pbs中移出不同的脑区域，并且用gentlemacstm解离器(miltenyibiotec)解离组织。从脑的侧脑室、第三脑室和第四脑室分离脉络丛组织，在含有400u/mliv型胶原酶(worthingtonbiochemical公司)的pbs(具有ca2+/mg2+)中于37℃孵育45min，然后通过吹打手工均质化。将脾用注射器的柱塞捣碎并用ack(氯化铵钾)裂解缓冲液处理以去除红细胞。在所有情况下，根据制造商的方案对样品进行染色。所有样品通过70μm尼龙网过滤，并用抗-fccd16/32(1:100；bdbiosciences)阻断。对于ifn-γ的细胞内染色，将细胞与对甲氧基苯丙胺(10ng/ml；sigma-aldrich)和离子霉素(250ng/ml；sigma-aldrich)孵育6h，并在最后4h添加布雷菲德菌素(brefeldin)-a(10μg/ml；sigma-aldrich)。用bdcytofix/cytopermtmplus固定/透化试剂盒(目录编号555028)完成细胞因子的细胞内标记。对于treg染色，使用ebiosciencefoxp3染色缓冲液组(目录编号00-5523-00)。以下荧光染料标记的单克隆抗体购自bdpharmingen,biolegend,r&dsystems或ebiosciences，并根据制造商的方案使用：pe或alexafluor450缀合的抗-cd4；pe缀合的抗-cd25；percp-cy5.5缀合的抗-cd45；fitc缀合的抗-tcrβ；apc缀合的抗-ifn-γ；apc缀合的抗-foxp3；亮紫缀合的抗-cd45。使用flowjo软件在lsrii细胞计数器(bdbiosciences)上分析细胞。在每次实验中，使用每个组织的相关阴性对照组、阳性对照和单染色样品来鉴别目标群体并排除其他群体。
bm嵌合体的制备.如先前所述(shechter等，2009；shechter等，2013)制备bm嵌合体。简单地说，使性别匹配的受体小鼠在防护头部的同时经受致死性全身辐照(950拉德)(shechter等，2009)。然后用来自cx3cr1gfp/+供体的5×106个bm细胞静脉内注射小鼠。在bm移植之后将小鼠放置8-10周，以使得能够重建造血谱系，之后将它们用于实验。通过对血液样品进行facs分析根据gfp表达细胞在循环单核细胞(cd11b+)中的百分比来确定嵌合性百分比。在这一防护头部的模型中，实现了平均60％的嵌合性，并且验证cns浸润性gfp+髓样细胞是cd45高/cd11b高，表示源于单核细胞的巨噬细胞而非小胶质细胞(shechter等，2013)。
莫里斯水迷宫.每天对小鼠进行三次试验，持续连续4天以学习发现池(直径为1.1m)中位于水表面下1.5cm的隐藏平台。将水温保持在21-22℃。用乳粉使水成不透明的。在测试室内，小鼠仅可利用远端的视觉形状和物体线索来帮助定位浸没平台。记录逃离潜伏期，即发现并爬上平台所需的时间，持续长达60s。允许每只小鼠在平台上停留15s，然后从迷宫移到其养笼中。如果小鼠在60s内未发现平台，则将其手工置于平台上，并在15s后返回到其养笼中。每只小鼠的试验间隔为10min。在第5天，将平台移除，并在没有可用逃离的情况下给予小鼠持续60s的单一试验。在第6天和第7天，将平台置于与原始训练象限相对的象限中，并且每天重新训练小鼠三次。使用ethovisionv7.1自动跟踪系统(noldusinformationtechnology)记录数据。使用方差分析(anova)和邦弗朗尼事后检验进行统计学分析。所有mwm测试均在熄灯阶段期间的上午10点到下午5点之间进行。
辐射臂水迷宫.使用辐射臂水迷宫(rawm)来测试空间学习和记忆，如先前所详细描述的(alamed等，2006)。简单地说，将六个不锈钢插入物置于箱中，形成从开放中央区域辐射的六个游泳臂。逃离平台位于直径1.1m的池中水平面以下1.5cm的一个臂(目标臂)的末端。将水温保持在21-22℃。用乳粉使水成不透明的。在测试室内，小鼠仅可利用远端的视觉形状和物体线索来帮助定位浸没平台。对于给定的小鼠，目标臂位置保持不变。在第1天，对小鼠15次试验(间隔3h)的训练，试验在可见平台和隐藏平台之间交替进行，并且最后4次试验只有隐藏平台。在第2天，对小鼠进行具有隐藏平台的15次试验的训练。将进入不正确的臂或在15秒内未能选择臂评分为错误。通过计算小鼠在每次试验时的进入错误的次数或逃离潜伏期来测量空间学习和记忆。训练数据被分析为对于三次连续试验的训练块(trainingblock)的平均错误或逃离潜伏期。
ga施用.用溶解于200μlpbs中的总剂量为100μg的ga(批号p53640；tevapharmaceuticalindustries,petahtiqva,israel)经皮下(sc)注射每只小鼠。根据每周一次的ga方案(butovsky等，2006)或每天一次的ga施用(图8和图16)注射小鼠。在最后一次ga注射后1周或在治疗后1个月，使小鼠安乐死，如针对每次实验所示。
treg的条件消融.连续4天，每天一次经腹膜内(ip)向foxp3lucidtr小鼠注射白喉毒素(dtx；8ng/g体重；sigma)(suffner等，2010)。通过血液和脾中免疫细胞的流式细胞术分析确认dtx的效率，实现表达gfp的foxp3+cd4+treg细胞的几乎完全(>99％)消耗(图4)。
p300抑制.类似于先前所描述的(liu等，2013)，进行对小鼠中的p300的抑制。将p300i(c646；tocrisbioscience)溶解于dmso中并每天一次经腹膜内注射(8.9mgkg-1d-1，ip)1周。用dmso类似地注射媒介物治疗的小鼠。
atra治疗.类似于先前所描述的(walsh等，2014)，进行向小鼠的全反式视黄酸(atra)施用。在1周过程中每隔一天将atra(sigma)溶解于dmso中并经腹膜内注射(8mgkg-1d-1)。用dmso类似地注射媒介物治疗的小鼠。
可溶性aβ(saβ)蛋白质的分离和定量.如先前所述(schmidt等，2005)进行组织均质化和saβ蛋白质提取。简单地说，将大脑脑实质解剖并速冻，并且保持在-80℃直到均质化。从样品中依序提取蛋白质以获得含有不同溶解度的蛋白质的分离级分。在杜恩斯(dounce)均质器中使用研磨玻璃杵将样品在含有250mm蔗糖、20mmtris碱、1mm乙二胺四乙酸(edta)和1mm乙二醇四乙酸(ph7.4)的10体积的冰冷组织均质化缓冲液中均质化。在6次冲击(stroke)后，将均质物与0.4％二乙胺(dea)在100mmnacl溶液中以1:1混合，然后再进行6次冲击，然后在4℃以135,000g离心45min。收集上清液(含有细胞外蛋白质和胞质蛋白质的dea可溶性级分)并用10％的0.5mtris-hcl(ph6.8)中和。根据制造商的说明书使用市售试剂盒(biolegend；分别为编号sig-38954和编号sig-38956)通过酶联免疫吸附测定(elisa)从可溶性级分单个地测量aβ1-40和aβ1-42。
aβ斑块定量.从每个脑中收集6μm的冠状切片，并且对来自整个目标区域(齿状回或大脑皮质)中的四个不同预定深度的每只小鼠的八个切片进行免疫染色。使用image-proplus软件(mediacybernetics,bethesda,md,usa)进行正染色的像素的基于直方图的分割。将分割算法手工应用于齿状回区域或皮质层v中的每个图像，并确定总aβ免疫染色所占区域的百分比。从相同的6μm冠状脑切片对斑块数量进行定量，并将其呈现为每个脑区域的平均斑块数。在定量之前，将切片编码以掩盖实验组的身份，并且由对所述组的身份不知情的观测者对斑块负荷进行定量。
统计学分析.附图说明中示出了用于分析每组实验的具体测试。使用双尾学生t检验对数据进行分析以在两组之间进行比较，使用单因素方差分析比较几个组，之后用纽曼-科伊尔斯事后程序在零假设被拒绝(p<0.05)之后进行组的成对比较。使用两因素重复测量方差分析来分析来自行为测试的数据，并将邦弗朗尼事后程序用于后续成对比较。基于文献和过去的经验，选择具有足够的统计检力的样本大小，并根据年龄、性别和基因型将小鼠分配到实验组。在实验和结果评估期间，调查人员对所述组的身份不知情。所有纳入和排除准则都是根据iacuc指南预先确定的。以平均值±s.e.m.表示结果。在图中，y轴误差棒表示s.e.m.。使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,sandiego,ca)进行统计学计算。
实施例1.在ad小鼠模型中沿疾病进展的脉络丛(cp)网关(gateway)活性.
我们首先检测了5xfadad转基因(ad-tg)小鼠模型中沿疾病进展的cp活性；这些小鼠共表达与家族性ad相关的五种突变，并且早在2月龄时即发生大脑aβ病理和神经胶质增生(oakley等，2006)。我们发现，沿着疾病病理进展阶段，与年龄匹配的野生型(wt)对照相比，ad-tg小鼠的cp表达显著更低水平的白细胞归巢和运输决定子，包括icam1、vcam1、cxcl10和ccl2(图1a)，所述决定子显示由cp响应急性cns损伤而上调，并且对于白细胞的经上皮迁移是所需的(kunis等，2013；shechter等，2013)。对于整合素配体icam-1的免疫组织化学染色确认了其由ad-tg小鼠的cp上皮的表达降低(图1b)。另外，对人死后脑内icam-1的染色显示其在cp上皮细胞中与年龄相关的降低，这与我们之前的观测结果(baruch等，2014)一致，并且对该作用的定量评估揭示与没有cns疾病的年长个体相比在ad患者中的进一步下降(图2a)。由于cp对白细胞运输决定子的诱导取决于上皮干扰素(ifn)-γ信号传导(kunis等，2013)，因此我们接下来测试观测到的作用是否可反映cp处ifn-γ可用性的损失。使用流式细胞术细胞内染色对5xfadad-tg小鼠的cp的检查揭示该区室中显著更低数目的产生ifn-γ的细胞(图2b)，并且定量实时pcr(rt-qpcr)分析确认ad-tg小鼠与年龄匹配的wt对照相比在cp处的ifn-γ的更低的mrna表达水平(图2c)。
调节性t细胞(treg)在抑制系统性效应性免疫应答中起关键作用(sakaguchi等，2008)。我们设想treg介导的系统性免疫抑制影响cp处的ifn-γ可用性，因此集中于treg在ad病理中的参与。与ad患者中升高的treg水平和抑制活性的先前报道(rosenkranz等，2007；saresella等，2010；torres等，2013)一致，评价5xfadad-tg小鼠相对于它们的年龄匹配的wt同窝在脾细胞中的foxp3+treg频率揭示了它们沿疾病进展的升高的水平(图3a、3b)。为研究treg介导的系统性免疫抑制、cp网关活性和ad病理之间的功能关系，我们将5xfadad-tg小鼠与foxp3-白喉毒素受体(dtr+)小鼠杂交，使得能够通过施用白喉毒素(dtx)在ad-tg/dtr+小鼠中实现foxp3+treg的短暂的条件性体内消耗(图4a)。相对于dtx治疗的ad-tg/dtr-同窝，treg的短暂消耗导致ad-tg/dtr+小鼠的cp的白细胞运输分子的升高的表达(图5a)。对短暂treg消耗对脑实质的长期作用(3周后)的分析揭示了脑中的免疫细胞累积，包括升高数量的cd45高/cd11b高髓样细胞(代表浸润性mo-mφ(shechter等2013年))和cd4+t细胞(图5b)。另外，treg的短期暂时消耗导致累积在脑内的cd4+t细胞中foxp3+treg的显著富集，如通过流式细胞术所评估的(图5c、5d)。对海马的rt-qpcr分析显示foxp3和il10mrna的增加表达(图5e)。
接下来我们检查了treg的短期消耗(其后是免疫调节细胞在脑病理部位的累积)是否导致对脑功能的长期作用。我们观察到海马神经胶质增生的减少(图5f)和促炎细胞因子(例如il-12p40和tnf-α)的降低的mrna表达水平(图5g)。此外，海马齿状回和大脑皮质(第5层)(在5xfadad-tg小鼠中展现出强烈的aβ斑块病理的两个脑区域(oakley等，2006))中的大脑aβ斑块负荷降低(图6a、6b)。使用莫里斯水迷宫(mwm)测试来评价对认知功能的作用揭示相对于经dtx治疗的ad-tg/dtr-年龄匹配小鼠，在treg消耗之后，ad-tg/dtr+小鼠中空间学习和记忆的显著改善，达到与wt小鼠类似的表现(图6c-e)。总之，这些数据证实短暂破坏ad-tg小鼠中的treg介导的系统性免疫抑制导致炎症消退细胞(包括mo-mφ和treg)在脑中的累积，并且之后是神经炎症应答的消退、aβ的清除和认知衰退的逆转。
实施例3.共聚物-1的每周施用降低treg介导的系统性免疫抑制，改善cp网关活性并减轻ad病理.
为了进一步证实系统性免疫抑制、cp功能和ad病理之间相反关系的因果性质，我们接下来使用免疫调节化合物格拉默(ga；也被称为共聚物-1或，其在每周一次的施用方案中被发现在ad的app/ps1小鼠模型中具有治疗效果(butovsky等，2006)；该效果在功能上与mo-mφ募集到疾病病理的大脑部位相关(butovsky等，2007)。这里，我们首先检查app/ps1ad-tg小鼠中的cp是否与我们在5xadad-tg小鼠中的观测结果类似，也在ifn-γ表达水平方面不足。我们发现，在app/ps1ad-tg小鼠中，相对于年龄匹配的wt对照，cp处的ifn-γ水平降低(图7a)。这些结果激励我们测试app/ps1小鼠(butovsky等，2006)中每周一次的ga的治疗效果是否可在5xfadad-tg小鼠中再现，以及如果是的话，它是否会影响系统性treg和cp针对mo-mφ运输的激活。因此，我们在4周的时期内用每周一次的ga施用方案(下文为“每周一次的ga”，示意性地描绘于图8a中)治疗5xfadad-tg小鼠。我们发现用每周一次的ga治疗的5xadad-tg小鼠显示出降低的神经炎症(图8b-d)，以及在所述治疗后持续长达2个月的认知表现的改善(图8e-i)。通过流式细胞术检查每周一次ga对系统性免疫和cp的作用，我们发现治疗的5xfadad-tg小鼠的降低的脾细胞foxp3+treg水平(图9a)，以及在cp处产生ifn-γ的细胞的增加，达到与在wt对照中观察到的水平类似的水平(图9b)。在每周一次的ga治疗的小鼠中的cp处表达ifn-γ的细胞的升高水平伴随着白细胞运输分子的上调的上皮表达(图9c)。
为了检测浸润性mo-mφ进入cns，我们使用允许循环(绿色荧光蛋白质(gfp)+标记的)髓样细胞显现的5xfadad-tg/cx3cr1gfp/+骨髓(bm)嵌合小鼠(使用头部保护制备)(shechter等，2009；shechter等，2013)。我们发现与媒介物治疗的ad-tg/cx3cr1gfp/+对照相比，在每周一次的ga治疗后gfp+mo-mφ向cp和相邻脑室空间的归巢增加(图9d-e)。脑实质的免疫组织化学揭示在大脑斑块形成部位处存在gfp+mo-mφ累积(图9f)，并且在ad-tg非嵌合小鼠中通过对海马的流式细胞术分析对浸润性髓样细胞的定量显示增加数量的cd11b高cd45高表达细胞(图9g、9h)。总之，这些结果证实mo-mφ募集到ad病理部位、系统性treg水平的降低和cp的ifn-γ依赖性激活之间的功能性联系。
实施例4.使用小分子组蛋白乙酰基转移酶抑制剂对treg活性的干扰.
表明treg介导的系统性免疫抑制干扰抵抗ad病理的能力的以上发现使人联想到在癌症免疫疗法中归属于treg的功能，其中这些细胞阻碍了免疫系统组织有效的抗肿瘤应答的能力(bos和rudensky，2012；nishikawa和sakaguchi，2010)。因此，我们认为直接干扰foxp3+treg细胞活性的治疗在ad中可能是有利的。我们测试了p300i(c646(bowers等，2010))，一种p300的非肽抑制剂，p300是调节treg功能的组蛋白乙酰基转移酶(liu等，2013)；该抑制剂显示影响treg抑制活性，同时使保护性t效应性细胞应答完好无损(liu等，2013)。我们发现与媒介物(dmso)治疗的对照相比，用p300i治疗的小鼠显示在脾(图10a)以及cp(图10b)中系统性的ifn-γ表达细胞的升高水平。我们接下来在1周的过程中用p300i或媒介物治疗ad-tg小鼠，并在3周后检查它们的大脑aβ斑块负荷。免疫组织化学分析揭示经p300i治疗的ad-tg小鼠中大脑aβ斑块负荷的显著降低(图10c-e)。我们还测试了一个疗程后对斑块病理的作用是否会持续超过3周，以及如果是的话，另外的疗程是否会有助于持久的作用。因此，我们比较了接受单个p300i疗程并且在2个月后检查的ad-tg小鼠与在此期间接受两个疗程(其间有1个月的间隔)的年龄匹配组(示意性地描绘于图10f中)。我们发现，大脑斑块负荷的降低即使在单个疗程后两个月也是明显的，但在接受两个疗程(其间有1个月间隔)的小鼠中更强(图10g)。由于ad中受损的突触可塑性和记忆与可溶性aβ1-40/aβ1-42(saβ)的升高大脑水平相关(shankar等，2008)，因此我们还测量了单个或重复p300i治疗周期后的saβ水平。我们再次发现，一个疗程和两个疗程(其间有1个月间隔)均可有效降低大脑saβ，但该作用对于对saβ1-42的作用在重复疗程后更强(图10h)。这些结果表明，虽然单一短期疗程是有效的，但重复疗程将有利于维持持久的治疗作用，这类似于我们在每周一次的ga治疗后的观测结果。
我们首先测试了靶向pd-1抑制途径是否可影响5xadad转基因(ad-tg)小鼠中的ifn-γ相关性系统性免疫(oakley等，2006)，所述小鼠共表达与家族性ad相关的五种突变。在第1天和第4天对10月龄(大脑病理处于晚期的时间点)的ad-tg小鼠施用针对pd-1的阻断抗体(抗-pd-1)或igg对照抗体的两次腹膜内(ip)注射，然后在第7天检查。流式细胞术分析揭示pd-1途径的阻断导致产生ifn-γ的cd4+t脾细胞的频率升高(图11a、11b)。
表2.与图11有关的go注释.
接下来我们检查这种系统性免疫应答是否影响cp活性。cp的全基因组rna测序(未显示；完整的分析将由本发明人在具有实施例5标题的报告中公开，并且其可在请求时从发明人获得)显示了与对ifn-γ的应答相关的表达谱(图11d和表2)，并且实时定量pcr(rt-qpcr)验证了当与igg治疗或未治疗的ad-tg对照相比时cp处升高的ifn-γmrna水平(图11c)。这些发现确认pd-1阻断后的系统性和cp组织特异性ifn-γ免疫应答，并且激励我们接下来测试对疾病病理的作用。
为了检查pd-1阻断对ad病理的功能影响，我们用抗-pd-1或igg对照抗体处理10月龄的ad-tg小鼠，并使用辐射臂水迷宫(rawm)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。
在治疗(两次腹膜内注射，间隔3天)后一个月，相对于igg治疗或未治疗的年龄匹配的对照，抗-pd1治疗的ad-tg小鼠展现出认知功能的显著改善，达到与年龄匹配的wt小鼠类似的认知水平(图12a)。我们接下来测试pd-1阻断对ad-tg小鼠中的认知表现的益处是否会持续超过1个月，以及另外的治疗期是否会是有利的。我们在10月龄(“1期”)时或在10月龄和11月龄(“2期”)时用抗-pd-1治疗ad-tg小鼠，并且在12月龄时检查了对认知表现的结果(示意性地示于图12b中)。对照组包括wt小鼠、未治疗的ad-tg小鼠和接受两期igg治疗的ad-tg小鼠。我们发现虽然单期的抗pd-1施用在治疗后1个月对空间学习和记忆具有有益作用(图12a)，但在接受单期治疗且2个月后测试的小鼠中未能检测到显著的作用(图12b)。相比之下，接受两期(间隔1个月)的抗pd-1的ad-tg小鼠在两个月的时限结束时展示与wt小鼠类似的认知表现(图12b)。
我们检查pd-1阻断是否影响如表现为大脑aβ斑块负荷和神经胶质增生的ad病理。通过针对aβ和胶质原纤维酸性蛋白质(gfap)的免疫组织化学对接受一期或两期抗-pd-1或igg的ad-tg小鼠的脑进行检查。我们发现海马齿状回(图13a、13b)和大脑皮质(第5层)(图13a、13c)(在5xfad小鼠中展现出强烈的aβ斑块病理的两个脑区域(oakley等，2006))中的大脑aβ斑块负荷降低。对aβ清除的作用在单期抗pd-1施用后是明显的，并且在两期之后更稳健。gfap免疫染色的定量分析显示相对于igg治疗的对照，在用1期pd-1阻断治疗的ad-tg小鼠和用2期pd-1阻断治疗的ad-tg小鼠两者中减少的海马星形胶质细胞增生(图13a、13d)。
为了研究施用的剂量和频率的作用，用抗-pd-1特异性抗体(igg2a抗小鼠pd-1或igg对照(大鼠igg2a))治疗雌性5xfadad转基因小鼠(平均队列年龄为6个月)。抗-pd-1治疗的小鼠在实验的第1天接受500ug抗体的1次注射，或在注射之间有3天间隔的250ug的两次注射。将年龄匹配的野生型(wt)小鼠用作另外的对照组。我们使用辐射臂水迷宫(radialarmwatermaze)(rawm)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。
在治疗(两次腹膜内注射，间隔3天)后一个月，相对于igg治疗或未治疗的年龄匹配的对照，抗-pd1治疗的ad-tg小鼠展现出认知功能的显著改善，达到与年龄匹配的wt小鼠类似的认知水平(图14)。
最后，用抗-pd-1特异性抗体(igg2a抗小鼠pd-1)或igg对照(大鼠igg2a)，每月一次地以重复治疗期治疗雄性5xfadad转基因小鼠。第一次注射在3月龄，第二次注射在4月龄，并且第三次注射在5月龄。在实验设计的方案中指示剂量(图15a)。将年龄匹配的野生型(wt)小鼠用作另外的对照组。我们在两个不同的时间点(5月龄(图15b)和6月龄(图15c))使用辐射臂水迷宫(rawm)任务评价了对空间学习和记忆表现的作用。呈现了实验设计。黑色箭头指示治疗的时间点，并且插图指示认知测试的时间点。抗-pd-1治疗的5xfad小鼠(n＝7)、igg2a治疗的5xfad小鼠(n＝9)和wt(n＝8)对照的rawm表现；两因素重复测量方差分析和杜奈特事后检验)。误差棒表示平均值±s.e.m.；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，抗-pd-1治疗的小鼠相对于igg治疗的对照。这些发现证实，用pd-1阻断进行的重复期的治疗不仅可在疾病的晚期阶段给予5xfad小鼠时逆转疾病进展，而且可在认知衰退前的早年开始治疗时延缓疾病的发作(图15b-c)。
实施例6.免疫检查点阻断在阿尔茨海默病中的治疗潜力.
为了测试阻断免疫检查点是否可减弱ad病理，用以下抗-检查点抗体之一治疗6到10月龄的ad-tg小鼠：抗-icos抗体、抗-b7rp1抗体、抗-vista抗体、抗-cd40抗体、抗-cd40l抗体、抗-cd80抗体、抗-cd86抗体、抗-b7-h3抗体、抗-b7-h4抗体、b7-h7抗体、抗-btla抗体、抗-hvem抗体、抗-cd137抗体、抗-cd137l抗体、抗-ox40l抗体、抗-cd-27抗体、抗-cd70抗体、抗-sting抗体或抗-tigit抗体。用作为阳性对照的抗-pd-1抗体、作为阴性对照的igg对照或抗-pd1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠。将在治疗后一个月使用辐射臂水迷宫(rawm)任务测量对空间学习和记忆表现的治疗作用、通过针对aβ的免疫组织化学测量aβ斑块负荷和通过针对胶质原纤维酸性蛋白质(gfap)的免疫组织化学法测量海马星形胶质细胞增生。
预期用所述抗体治疗的小鼠展示出与igg治疗和未治疗的ad-tg小鼠相比显著的认知改善以及大脑斑块负荷的显著降低。
实施例7.免疫检查点阻断方法在ptsd病理中的治疗潜力.
严重应激病况或慢性应激可导致创伤后应激障碍(ptsd)和抑郁症。我们采用生理性ptsd样动物模型，其中小鼠展现出过度警戒行为、注意力受损、风险评估增加、睡眠不好(lebow等，2012)。在ptsd诱导的该实验模型中，使小鼠对相反的日/夜周期适应10天，遭受两次电击(创伤和触发)(称为“ptsd诱导”)，并且在创伤后的不同时间点进行评价。在创伤事件之后，用阻断免疫检查点的所述化合物注射小鼠。根据以下方案之一治疗小鼠：
用以下抗检查点抗体之一治疗小鼠：单独或与抗-ctla-4抗体组合的抗-icos抗体、抗-b7rp1抗体、抗-vista抗体、抗-cd40抗体、抗-cd40l抗体、抗-cd80抗体、抗-cd86抗体、抗-b7-h3抗体、抗-b7-h4抗体、b7-h7抗体、抗-btla抗体、抗-hvem抗体、抗-cd137抗体、抗-cd137l抗体、抗-ox40l抗体、抗-cd-27抗体、抗-cd70抗体、抗-sting抗体或抗-tigit抗体。用作为阳性对照的抗-pd-1抗体、作为阴性对照的igg对照或抗-pd1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠。
一些小鼠接受有适当的间隔期的额外的治疗期。
实施例8.免疫检查点阻断方法在帕金森氏病病理中的治疗潜力.
在这些实验中使用帕金森病(pd)转基因(tg)小鼠或mptp诱导的pd小鼠模型。根据以下方案之一，在疾病的进展阶段治疗小鼠：
用以下抗检查点抗体之一治疗pd-tg小鼠：单独或与抗-ctla-4抗体组合的抗-icos抗体、抗-b7rp1抗体、抗-vista抗体、抗-cd40抗体、抗-cd40l抗体、抗-cd80抗体、抗-cd86抗体、抗-b7-h3抗体、抗-b7-h4抗体、b7-h7抗体、抗-btla抗体、抗-hvem抗体、抗-cd137抗体、抗-cd137l抗体、抗-ox40l抗体、抗-cd-27抗体、抗-cd70抗体、抗-sting抗体或抗-tigit抗体。用作为阳性对照的抗-pd-1抗体、作为阴性对照的igg对照或抗-pd1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠。
使用例如评估小鼠停留在旋转杆上的能力的旋转杆表现测试(rotarodperformancetest)来评价运动神经功能。
预期与igg治疗的或媒介物治疗的对照组或未治疗的组相比，经一个治疗期治疗的pd-tg小鼠显示显著改善的运动表现。预期接受两个疗程并在适当的间隔期后检查的pd-tg小鼠显示出持久的治疗作用。为了维持这种治疗效果，使小鼠经受在每个治疗期之间有适当的非治疗间隔期的积极治疗期。
实施例9.免疫检查点阻断在亨廷顿氏病病理中的治疗潜力.
用于这些实验中的模型可以是亨廷顿氏病(hd)r6/2转基因小鼠(tg)测试系统。r6/2转基因小鼠过表达突变的人亨廷顿基因，所述基因包含在疾病的进展阶段小鼠中多个cag重复的插入。这些小鼠显示早在5-6周龄开始并导致在10-13周时过早死亡的进行性行为-运动缺陷。症状包括低体重、紧握、震颤和惊厥。
当小鼠45天龄时，按照以下方案之一对它们进行治疗：
用以下抗检查点抗体之一治疗小鼠：单独或与抗-ctla-4抗体组合的抗-icos抗体、抗-b7rp1抗体、抗-vista抗体、抗-cd40抗体、抗-cd40l抗体、抗-cd80抗体、抗-cd86抗体、抗-b7-h3抗体、抗-b7-h4抗体、b7-h7抗体、抗-btla抗体、抗-hvem抗体、抗-cd137抗体、抗-cd137l抗体、抗-ox40l抗体、抗-cd-27抗体、抗-cd70抗体、抗-sting抗体或抗-tigit抗体。用作为阳性对照的抗-pd-1抗体、作为阴性对照的igg对照或抗-pd1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠。
使用例如评估小鼠停留在旋转杆上的能力的旋转杆表现测试来评价运动神经功能。
预期与igg治疗的或媒介物治疗的对照组或未治疗的组相比，经一个治疗期治疗的hd-tg小鼠显示显著改善的运动表现。预期接受两个疗程并在适当的间隔期后检查的hd-tg小鼠显示出持久的治疗作用。为了维持这种治疗效果，使小鼠经受在每个治疗期之间有适当的非治疗间隔期的积极治疗期。
实施例10.免疫检查点阻断方法在肌萎缩侧索硬化病理中的治疗潜力.
用于本实验中的模型可以是过表达含有gly93→ala(g93a)基因的缺陷型人突变sod1等位基因的转基因小鼠(b6sjl-tgn(sod1-g93a)1gur(本文中为“als小鼠”)。该模型发生运动神经元疾病，并且由此构成用于测试als的公认动物模型。
当小鼠75天龄时，按照以下方案之一对它们进行治疗：
用以下抗检查点抗体之一治疗小鼠：单独或与抗-ctla-4抗体组合的抗-icos抗体、抗-b7rp1抗体、抗-vista抗体、抗-cd40抗体、抗-cd40l抗体、抗-cd80抗体、抗-cd86抗体、抗-b7-h3抗体、抗-b7-h4抗体、b7-h7抗体、抗-btla抗体、抗-hvem抗体、抗-cd137抗体、抗-cd137l抗体、抗-ox40l抗体、抗-cd-27抗体、抗-cd70抗体、抗-sting抗体或抗-tigit抗体。用作为阳性对照的抗-pd-1抗体、作为阴性对照的igg对照或抗-pd1抗体与上述其他抗检查点抗体之一的组合治疗一些小鼠。
使用例如评估小鼠停留在旋转杆上的能力的旋转杆表现测试来评价运动神经功能，或允许小鼠抓握并保持到下端具有小环的垂直线(直径2mm)上。垂直线允许小鼠使用前肢和后肢两者来抓住线。所述线维持在24rpm的垂直定向圆运动(圆半径为10cm)。用计时器记录小鼠能够悬挂到线上的时间。
预期与igg治疗的或媒介物治疗的对照组或未治疗的组相比，经一个治疗期治疗的als小鼠显示显著改善的运动表现。预期接受两个疗程并在适当的间隔期后检查的als小鼠显示出持久的治疗作用。为了维持这种治疗效果，使小鼠经受在每个治疗期之间有适当的非治疗间隔期的积极治疗期。
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序列表
<110>耶达研究与开发有限公司
m·埃森巴赫-施瓦茨
k·巴鲁克
n·罗森茨魏希
<120>降低系统性调节性t细胞水平或活性来治疗cns的疾病和损伤
<130>yeda-127pct
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